完美的微生物疗法无需细菌？PNAS发脑洞文！

这是《肠道产业》第 192 篇文章

编者按：

虽然粪菌移植（FMT）为一些疾病的治疗带来了新希望，让我们看到了操纵微生物组的前景，但同时也让我们意识到当中的风险。

而为了规避这种风险，许多科学家开始尝试对微生物进行精确编辑。那么目前有哪些编辑手段与方法呢？

今天我们特别编译了近期发表在 PNAS 杂志上的 News Feature: Editing the microbiome 一文，以介绍当前微生物组编辑的现状与进展。同时，希望通过该文为各位产业人士和读者带来一些启发与提示。

新时代：合理设计微生物组

把一只肥胖老鼠体内的微生物移植到另一只瘦骨嶙峋的老鼠体内，即使不改变饮食、活动和其他生活习惯，瘦老鼠的体重也会增加¹。这些研究越来越清楚地表明，有机体内的共生微生物可以对宿主（包括人类）的健康产生重大的影响。

过去十年来的研究工作表明，我们体内的微生物能促进大脑发育、刺激免疫系统发育或者引起过敏²，并可能会诱发某些癌症。这些发现催生了益生菌、益生元、个人微生物组测序等产业。

但是，很少有治疗方法能够真正改变——更不用说改善——我们的共生菌群。部分原因在于对这些微生物动态变化的观察，离我们充分了解它们的运行机制并实现有效和安全的干预，还差一步。

粪菌移植（FMT）已经证实了操纵微生物组的前景和风险。对于那些正在反复与艰难梭状芽胞杆菌感染作斗争的绝望的病人来说，从一个健康人的肠道移植全部细菌到另一个病人的肠道，即可缓解相关症状³。

然而，即使 FMT 起作用，我们也没有办法对其效果进行标准化或者量化。

最近的几起由 FMT 引起的严重副作用的案例（包括一例死亡），导致 FDA 暂停了所有 FMT 的临床试验。该举措将一直持续到有新增的安全措施部署到位⁴。

“我们真的不知道 FMT 可能导致的长期后果，” 北卡罗来纳州立大学的微生物学家 Casey Theriot 说，“它的确可以挽救生命，但是我们并不想利用它解决所有问题。我们需要更加明确的细菌疗法。”

Theriot 和其他公司正致力于研究靶向疗法和开发用于精确编辑微生物的工具，以实现治疗疾病的目的。

基于对内部生态系统如何在特定情况下运作、改变和控制我们的健康等问题的理解，研究人员们已可以在不破坏更大的微生物群落的情况下，去除病原体或增强代谢功能。

“在过去的几年里，情况发生了巨大变化。我们已从简单地观察健康和疾病个体中的微生物，进步到可将它们与宿主体内的生物活动联系起来。”斯坦福大学的微生物学家 Justin Sonnenburg 说。

Sonnenburg 表示：“这是向‘理解微生物功能’的过渡，它将引领我们进入一个‘合理设计微生物组’的时代。”

扫描电子显微照片：艰难梭状芽胞杆菌 

图片来源:ScienceSource/Paul Gunning

锁定单个物种

对于因其他疾病而住院的病人来说，感染艰难梭菌是一件很令人头疼的事情。但它对于研究人员来说，却极具吸引力。因为我们已经知晓病原体与共生微生物及肠道环境之间如何发生互作。

“我们清楚地知道，在这些感染发生后，应该去做些什么。” Theriot 说，“微生物组、代谢物和艰难梭菌感染之间，究竟发生什么联系，这已经很清楚。”

在一个健康的肠道中，共生梭状芽胞杆菌和其他种类的细菌，会阻止艰难梭菌的增殖。在一定程度上，这是通过竞争病原体所需的共同营养物质来实现的。

但是抗生素会杀死这些共生菌，如果没有这些有益微生物及其产生的化学信号，艰难梭菌就会对肠道造成严重的感染⁵。

患者此时会出现腹泻、恶心和腹痛，而医生会再次给他们开具抗生素以治疗这些症状。这些药物可治愈大多数艰难梭菌感染患者的感染，但至少有 30%的患者会出现病情恶化。由于致病的艰难梭菌比其它共生菌恢复得更快，这就需要再使用一轮抗生素治疗⁶。

这种再度感染的循环往复会持续数年，这也是为什么绝望的病人们会采取一些极端的措施，比如自己动手去做 FMT。

Theriot 和她的团队希望通过不抑制共生细菌的方法来治疗艰难梭菌，因此研究人员们将注意力转向了一种工程噬菌体。

这种噬菌体是由位于北卡罗来纳州莫里斯维尔的初创公司 Locus Biosciences 生产的，该噬菌体可特异结合到某些细菌种类上。

先前的研究表明，噬菌体的使用可能是治疗艰难梭菌感染复发的有效策略⁷。

该公司设计了特异针对艰难梭菌的噬菌体，让它们在自己的基因组中携带并编码一种名为 CRISPR-Cas3 的基因编辑系统的 DNA 序列。该公司的科学顾问 Theriot 说，Cas3 酶“像吃豆人咀嚼 DNA 一样”，切割整个目标细菌的基因组。

在未发表的研究中，Theriot 的团队发现，在实验中，对感染艰难梭菌的小鼠，持续 3 天每天 2 次投喂包含 cas3 的噬菌体，可以减少疾病的临床症状，如水肿、体重减轻和肠上皮表面损伤，同时病原体的水平也会显著降低。

Theriot 表示，这项工作初步证明了该策略的可行性。

这种策略相当于对细菌发起直接攻击，而另外一种方法是改变目标病原体赖以生存的微环境使其变得不适宜生存。

加州大学戴维斯分校的微生物学家 Andreas Bäumler 的切入点是抗生素导致人体细胞的代谢紊乱。他的想法是，尝试降低环境对碳青霉烯耐药性肠杆菌（如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌）的友好性，而这些细菌也正是那些孱弱的住院病人们面临的主要感染威胁。

破坏肠道菌群的药物，会使微生物和人体细胞之间发生的化学反应消失一半。在这种情况下, 肠上皮细胞开始产生更多的氧气和硝酸盐，而这恰恰是碳青霉烯耐药性肠杆菌定殖生长所需的环境⁸。

由于患者有可能仍在服用抗生素, 所以利用益生菌来促进恢复完整健康的微生物组并不可行, 原因在于这些益生菌同样对抗生素很敏感。

因此，Bäumler 和他的同事们试图通过重新引入缺失的、能指导肠道细胞活性的微生物，来恢复健康微生物环境所必需的关键因子。

他们的团队使用了一种“仿生学”药物（一种叫做 5-氨基水杨酸的常用药物）。该药物已经与大肠杆菌属的一种益生菌菌株联合使用，以用于治疗炎症性肠病。

他们发现，药物与益生菌联合使用的方法，可以保护模型动物免受碳青霉烯耐药性肠杆菌的侵袭。Bäumler 的实验室前博士后 Erin Olsan 在旧金山举行的美国微生物学会年会上表示，这种治疗方案起到了与完整的 FMT 同样的效果⁹。

Bäumler 将这些细菌感染与寻找治疗方法时遇到的挑战，比作“抢椅子游戏”。

当我们的微生物群落建立时，我们的饮食、免疫系统和许多其他因素，共同决定了大肠内微生物的饮食选择，从而决定了哪些共生菌将会“吃得好”并能够在我们的肠道内繁衍生息。

在一个健康、成熟的肠道生态系统中，餐桌上的每个地方都坐得满满的，没有地方留给病原体。这种所谓的定殖抗性，使健康的微生物群“抗拒改变”，同时也为开发具有持久效果的治疗方案带来了许多困难。

而在患者或服用抗生素的人的微生物组中，许多“就餐者”被从他们通常占据的位置上赶了下来。

Bäumler 说，使用仿生学药物或肠道菌群产生的小分子，就好比把一件夹克放在椅子上，然后声称这就是自己的地盘。

虽然这些方法被证明对艰难梭菌或碳青霉烯类耐药肠杆菌等具体的目标是行之有效的，但是在治疗其他疾病时，这些方法可能就变得“捉襟见肘”了。

“这个问题经常出现，因为在炎症性肠病、肥胖症或结肠癌等疾病中，我们不知道哪些微生物是重要的。” Theriot 说。

扫描电子显微照片：肺炎克雷伯菌

图片来源: Flickr/NIAID

微生物基因治疗

将“罪魁祸首”锁定到单一细菌物种，几乎是不可能的，但这也可能是不必要的。

“‘一次一个漏洞’的研究策略，有助于我们理解细菌的生理功能,” 纽约哥伦比亚大学的 Harris Wang 说，“但在复杂的群落环境中，你可能永远无法以这种方式把问题分解成单个元素。”

他说，要使这一领域取得进展，研究人员必须在整个群落层面上进行研究和实验操作，而不仅仅是在实验室培养的单个菌株上。

他解释说，要了解某种基因或代谢功能是否有助于某种微生物在肠道中定殖，最可靠的方法就是移除该基因或代谢途径，并测试移除后该细菌在肠道中的定殖能力。

他说，Harris Wang 的研究正是基于这样一种需求所开展开发出的工具，以实现对微生物群落的精确操纵：既可添加功能，也可移除功能。

Harris Wang 的团队的目标是进行他所谓的“微生物基因治疗”，即将选定的基因和信号通路传递到一个已建立的原生微生物群落中，然后该群落就可以保存这些获得性能力，并随着时间的推移稳定地传播它们。

为此，他的团队将研究重点放在被称作质粒的可移动 DNA 片段上，细菌可以复制这些质粒并将其传递给邻近的细胞，而它们本身或受体细胞的染色体并不会被改变。与噬菌体（拥有非常特定的宿主）不同的是，质粒可以被调整使其可集体传递或者只传递给特定的宿主。

在最近的一项研究中，研究小组改造了大肠杆菌，使其携带一种广谱的宿主质粒，可以在相互接触的细菌之间传递。他们利用一种基因来产生荧光标记，发现用这种大肠杆菌菌株处理过的小鼠肠道细菌也携带了这种标记，并且这种标记广泛存在于多种共生物种中¹⁰。

原则上，这项技术可以被用于向细菌中添加编码代谢毒素或特定营养素的基因。即使改造过的大肠杆菌因为“无法在餐桌上找到位置”而无法在肠道中定植，它们所携带的质粒也应该能在肠道中的原生细菌物种中维持下去。

另一种增加功能并确保它们能稳定传递下去的策略是在晚餐菜单上为被改造的微生物添加一道“特殊的菜”。

去年，Sonnenburg 的团队发表了一项研究，阐明了拟杆菌属（美国成年人肠道中含量最多的细菌）是如何被调节来消化饮食中草酸盐的机理。

这些化学物质通常存在于西红柿、绿叶蔬菜、黑巧克力和其他的一些食物中。虽然富含草酸盐的食物对于大多数人来说是无害的，但它却会引起有肾结石病史的人旧病复发。

Sonnenburg 和他的同事们对拟杆菌进行了改造，使其携带编码草酸降解酶的基因。他们还添加了消化卟啉的基因。

卟啉是一种来自于可食用海藻的糖类物质，虽然它在西方标准饮食中并不常见，但它却是一种工程化微生物存活所必需的控制分子。

当老鼠被喂食这种多糖，然后用改造后的细菌进行感染后，该细菌便在小鼠肠道微生物群落中拥有了一个特殊的生态位¹¹。

“它使细菌能够独立于背景菌群工作，并达到高水平的可繁殖定殖，” Sonnenburg 说，“人们通常很难控制自己的饮食。所以这里的想法是，如果你的肠道里有这种治疗性微生物，你就无需费那么大力气在饮食中回避草酸盐了。”

类似地，对特定宿主微生物群落中的原生微生物进行工程改造，可能有助于确保它们在已经成功占据的生态位中生存下来。

加州大学圣迭戈分校的 Amir Zarrinpar 研究的是原生微生物群落中常见的微生物。他之所以选择该方向，其中的部分原因源自一个偶然的发现。

他的团队一直在研究大肠杆菌 Nissle，这是一种常见的实验室菌株，目前其他研究人员也正在探索它的治疗用途。但 Amir Zarrinpar 和他的团队发现，携带质粒的 Nissle 细菌在动物体内无法很好地繁殖。

在做相关实验时，Zarrinpar 实验室的前博士后 Steven Brown 发现另外一种大肠杆菌菌株（一种原生于老鼠肠道的菌株）似乎作用效果更好。他们将带有荧光标记的质粒导入原生微生物，该改造后的原生菌株便能更好的在老鼠肠道定殖¹²。

如果这种菌株改造后能携带编码特定代谢功能的基因，理论上讲,它可以重新整合到肠道微生物群落中并长久维持下去，并且不需要额外的营养物质，比如卟啉。

“改造原生细菌并不简单，因为它们有先天的防御机制来阻止自身的 DNA 被操纵，” Zarrinpar 说，“但如果我们对这些特征进行很好的研究，我们就可以利用它们来保护我们插入到细菌中的这些 DNA。”

他说，原生细菌的另一个优点是，它们可以用于人体的特定部位：寄生在上结肠粘液层的细菌与那些生活在被称为隐窝，也就是肠折叠深处的细菌是不同的。

因此，只需要简单地选择合适的菌株，便可将某项功能传递到身体的任意特定部位。

Zarrinpar 说：“更好地去研究原生细菌是非常有意义的，因为它们能够成为强大的载体。”

目前，这些研究主要是为某些原理寻找证据：使用像 GFP 这样的基因来编码生成荧光标记，进而显示这种方法是否有效。

“下一个巨大的挑战，是如何去证明我们可以在功能上操纵微生物群落，” Zarrinpar 补充道，“其次，是我们如何实现并控制对上述操作，使其作用于人类。”

微生物组疗法的未来没有微生物

最终，这些编辑微生物群落的方法不仅可以用来开发新的治疗方案，还可以用来建立追踪微生物新陈代谢的传感器。作为研究工具，它们将继续拓宽研究人员们对微生物促进人类健康和诱发疾病的机理的理解。

当前，一些发源于实验室的初创公司，已开始将一些微生物组编辑技术应用到临床研究，目前已有几个项目处于第一阶段的临床试验。

Locus Biosciences 开发的包含 cas3 的噬菌体正在进行应对艰难梭菌、尿路大肠杆菌以及其他细菌感染的测试工作。

位于美国马萨诸塞州剑桥市的 Synlogic 公司测试了几株共生大肠杆菌，这些大肠杆菌改造后携带填补代谢途径缺陷的基因，比如苯丙酮尿症(一种遗传病，患者缺乏降解某些氨基酸的酶)。他们开发的 SYNB1618 菌株可以在小肠中降解苯丙氨酸¹³。

总部位于美国加州旧金山的 SioltaTherapeutics 公司正在动物模型中测试一种可减少过敏反应（比如哮喘）的混合细菌¹⁴。

不断遇到的挑战和悬而未决的问题，肯定仍然存在。

治疗策略将需要克服原生微生物对“新居民”的抵抗力，不管这种抵抗力是暂时存在的还是永久持续的。

那些试图改造原生细菌的人们需要找到合适的遗传工具和适宜的细菌生长条件，因为它们中间有许多从未在实验室实验中被培养或改造过的细菌物种。

在插入质粒等 DNA 片段时，研究人员需要学习如何控制这些移动因子在野外环境中的扩散。

也许最重要的是，研究结果并不总是从老鼠身上转化到人类身上，甚至也不总是从早期的人类研究转化到后期的人类研究上。

Zarrinpar 说，最理想的情况是，研究人员们将利用这些工具彻底摆脱对微生物的使用。经过对微生物群活动的多年观察，以及从事合理的细菌设计的相关经验，研究人员将有能力鉴定出模拟或更好呈现微生物功能的小分子或疗法。

“完美的微生物组疗法不会使用微生物组，”他说。“取而代之的是，我们将找到微生物组影响人体生理变化的‘作用杠杆’，然后我们自己就可以直接对这些杠杆起作用，而不再依赖于细菌。”

 参考文献及原文链接：

（滑动下方文字查看）参考文献：
1.V. K.Ridaura et al., Gut microbiota from twins discordant for obesity modulatemetabolism in mice. Science 341, 1241214 (2013).2.E. M.Brown, D. J. Kenny, R. J. Xavier, Gut microbiota regulation of T cells duringinflammation and autoimmunity. Annu. Rev. Immunol. 37, 599–624 (2019).3.I.Youngster et al., Oral, frozen fecal microbiota transplant (FMT) capsules forrecurrent Clostridium difficile infection. BMC Med. 14, 134 (2016).4.U.S.Food and Drug Administration (2019). Important safety alert regarding use offecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse reactions dueto transmission of multi-drug resistant organisms.https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/important-safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-transplantation-and-risk-serious-adverse.Accessed 14 January 2020.5.M. C.Abt, P. T. McKenney, E. G. Pamer, Clostridium difficile colitis: Pathogenesisand host defence. Nat. Rev. Microbiol. 14, 609–620 (2016).6.S.Bibbò et al., Role of microbiota and innate immunity in recurrent Clostridiumdifficile infection. J. Immunol. Res. 2014, 462740 (2014).7.J. Y.Nale, T. A. Redgwell, A. Millard, M. R. J. Clokie, Efficacy of an optimisedbacteriophage cocktail to clear Clostridium difficile in a batch fermentationmodel. Antibiotics (Basel) 7, 13 (2018).8.S. E.Winter et al., Host-derived nitrate boosts growth of E. coli in the inflamedgut. Science 339, 708–711 (2013).9.E. E.Olsan, D. N. Bronner, C. Tiffany, E. Velazquez, A. J. Bäumler (2019).Development of faux-biotics to prevent CRE colonization after antibiotictreatment. ASM Microbe 2019, June 20–24, San Francisco, CA.https://www.abstractsonline.com/pp8/-!/7859/presentation/17292. Accessed 12November 2019.10.C.Ronda, S. P. Chen, V. Cabral, S. J. Yaung, H. H. Wang, Metagenomic engineeringof the mammalian gut microbiome in situ. Nat. Methods 16, 167–170 (2019).11.E. S.Shepherd, W. C. DeLoache, K. M. Pruss, W. R. Whitaker, J. L. Sonnenburg, Anexclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.Nature 557, 434–438 (2018).12.S. D.Brown, B. J. Russell, A. Zarrinpar (2019). Function delivery to theconventional mouse gut using native E. coli by stable maintenance of arecombinant plasmid. ASM Microbe 2019, June 20–24, San Francisco, CA.https://www.abstractsonline.com/pp8/#!/7859/presentation/17132. Accessed 12November 2019.13.V. M.Isabella et al., Development of a synthetic live bacterial therapeutic for thehuman metabolic disease phenylketonuria. Nat. Biotechnol. 36, 857–864 (2018).14.B. M.Fiebiger, R. B. Valladares, S. V. Lynch, N. E. Kimes, A live microbialbiotherapeutic product for induction of allergy-protective immunity. J. AllergyClin. Imunol. 143, AB68 (2019).
原文链接：
Madhusoodanan, Jyoti. "News Feature: Editing themicrobiome." Proceedings of the National Academy of Sciences 117.7 (2020):3345-3348.https://www.pnas.org/content/117/7/3345?ct

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作者｜Jyoti Madhusoodanan

编译｜朱国利

审校｜617

编辑｜崔心伟

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